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知识分享:腺相关病毒(AAV)表达系统hth华体会网页登录入口

2022-06-30 05:11 已有 人浏览 小编

  【维真生物】提供AAV现货和AAV包装服务,已助力多位客户在顶级期刊发表文章。

  维真生物保证您收到的产品符合产品目录上的规格。本担保规定了维真生物更换产品的责任。维真生物不提供其他任何形式的对于产品商业或健康用途的保证。维真生物不对任何由于使用或不正确使用本公司产品造成的直接、间接的、衍生的或偶然的损害所产生的后果负责。

  3. 请小心操作,避免产生气雾或飞溅。被病毒污染的超净工作台,请立即用70%乙醇加1% SDS溶液擦拭干净。接触病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请使用新鲜配制的10%漂白粉进行消毒操作后丢弃。

  4. 用显微镜观察细胞感染情况时,请先拧紧培养瓶或盖紧培养板,用70%乙醇擦拭培养瓶外壁后,显微镜下观察拍照。观察完毕,请用70%乙醇再次擦拭显微镜实验台。

  5. 离心病毒时,应使用密封性好的离心管,或用封口膜封口后进行离心,请尽量使用组织培养室内的离心机。

  2. 在注射病毒或是其后的解剖时,使用一次性手术服或是相当的衣物,如果是感染细胞时,可以穿着实验服。

  4. 所有的操作应当是在 Class II 生物安全柜中进行。如果实验条件不能满足,则应当在空气稳定的空间中操作,减少操作时间和病毒与外界接触的时间。

  1. 病毒飞溅或是气溶胶与人体接触–眼,皮肤或是粘膜用大量清水冲洗眼睛或是其他接触的部位至少15 分钟。

  2. 含病毒的针头或是其他利器刺破皮肤。伤口立即用10%的碘伏溶液擦洗数分钟,然后用大量清水冲洗。

  ♦ 可以用它处理可回收的物品如玻璃器皿或是污染废液(终浓度是1%),但如果是不锈钢器物切不可直接擦拭,否则会引起表面腐蚀。

  其他的处理方式包括用2%戊二醛溶液或是0.25% SDS 溶液,还可以121℃高温消毒1小时。

  收到产品后,hth华体会网页登录入口请根据实验所需的量在无菌操作台中将病毒进行分装,并于-80 ℃冰箱冻存。分装病毒时请将病毒始终放置在冰上。

  【维真生物】提供AAV现货和AAV包装服务,已助力多位客户在顶级期刊发表文章。

  AAV载体概述【更多内容详见(维真生物官网→病毒包装→腺相关病毒→病毒简介)】

  腺相关病毒(AAV)是一种无包膜的单链DNA病毒,是细小病毒家族的一员,通常需要腺病毒、疱疹病毒等辅助病毒的帮助,才能进行自我复制。在没有辅助病毒的情况下,

  AAV可在哺乳动物细胞中长期潜伏。现阶段已发现的 AAV 有 12 种的血清型(AAV1 至 AAV12)和 130多种突变型[1] 。不同AAV血清型具有不同的衣壳蛋白空间结构、序列和组织特异性,因而其识别与结合的细胞表面受体也相应有很大差别[2],这也导致不同血清型转染的细胞类型和感染效率也各不相同。在基因治疗中,将携带有外源基因的重组腺相关病毒定点整合到宿主基因组,既能克服随机插入所导致的染色体缺失和基因重排等潜在危险,又可以达到长期治疗的目的。

  野生型AAV基因组编码两大开放阅读框架(open reading frames,ORF) rep和cap,它们位于两侧的末端倒转重复序列(interted teminal repeats,ITRs)之间。在 维真生物的AAV 病毒基因传递系统中,只有ITRs是复制和包装所必需的顺式元件,rep和cap 基因从病毒载体中被转移到辅助质粒AAV rep/cap Vector中,转移后空出的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的最大限度。在辅助质粒Ad Helper Vector和pAAV-rep/cap Vector的帮助下,仅需两端的 ITR 就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒。

  重组腺相关病毒是基因传递和表达的一个重要工具[3],其具有广泛的宿主范围及组织感染能力,既能感染分裂细胞,也能转导外源基因进入非分裂细胞,hth华体会网页登录入口长期表达外源基因,而不依赖于宿主细胞活跃的分裂能力。在维真生物公司的AAV病毒基因传递系统中,包含末端重复序列(ITRs)的载体质粒pAV-FH AAV 载体与包含rep/cap 基因的辅助质粒pAAV-rep/cap载体没有任何共同区域,避免通过重组而恢复出野生型病毒,宿主细胞免疫反应被降至最低,从而允许对具有免疫能力的宿主细胞进行基因传递。我们的AAV病毒基因传递系统可以生产出重组病毒滴度≥1011 病毒颗粒/毫升的病毒,浓缩后滴度最高可达1014 病毒颗粒/毫升,可以最大程度保证在动物细胞中的基因传递。rAAV进入细胞后,作为附加的DNA能稳定存在。基因的表达通常在第2〜7天出现峰值,并可在体内持续数周甚至数月。

  3.安全性高:ITR 序列和 rep/cap 基因分别由独立的质粒表达;未发现AAV对人体致病,rAAV去除了wtAAV基因组的96%,进一步保证了安全性;

  4.免疫原性低:AAV2 的基因组仅 4681 个核苷酸,便于用常规的重组 DNA技术进行操作,而且进行动物实验时造成的免疫反应小;

  2) 货期短:AAV克隆载体均与我们18,000个预制人类全长cDNA ORF克隆载体MCS区通用,行业中的生产周期短;

  维真生物独有的专利技术和创新性的rAAV载体和完善的AAV 表达系统,可用于体内和体外表达shRNA,human ORF和CRISPR,具有稳定可靠、重复性好、纯度高、滴度高的优点。

  AAV无辅助病毒系统(AAV Helper-Free System)可以在无辅助病毒的条件下生产出重组人腺相关病毒。这种系统利用已经明确与调节AAV 复制和表达的腺病毒基因产物,并且将这些基因产物通过转染引进宿主细胞。重组腺相关病毒(rAAV)由多个质粒(Cis质粒、辅助质粒、Rep/Cap质粒)组成。生产具感染性的AAV 病毒颗粒所需的腺病毒基因产物(例如:E2A,E4 和VA RNA 基因)大部分由与其他质粒共转染进细胞的pHelper 质粒提供,其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1 基因的AAV-293T 宿主细胞提供。Rep 和Cap 基因从病毒载体中被转移到辅助质粒pAAV-RC 中,AAV ITRs 仍位于病毒载体中,实际上在辅助质粒的帮助下,仅需两端的ITR 就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒,Rep 和Cap 基因的转移后空出的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的最大限度。Cis质粒、辅助质粒与Rep/Cap质粒之间不具有同源性序列,因此重组AAV在理论上不具有复制的能力。维真生物的腺相关病毒载体ITR序列Rep/Cap基因分别由独立的质粒表达,具有高度安全性。图1为rAAV进入细胞和转运的过程。

  维真生物为您提供了多种表达shRNA的rAAV,包括U6或H1启动子和作为哺乳动物表达标记的GFP或RFP。同时,也可根据您感兴趣的基因提供shRNA设计服务。

  腺相关病毒载体能够感染分裂和非分裂细胞。毒性和免疫原性低,适合以相对较高的转染效率在非分裂细胞中长期表达和在分裂细胞中短期表达基因。但AAV载体的外源基因容纳量有限,两个ITR之间的空间只有4.9kb,因此可插入的外源基因为3.5kb甚至更小。请参阅本表选择适合您的病毒载体系统。

  第一步:基因克隆。将外源基因克隆进入维真生物公司的人源或shRNA腺相关病毒载体,pAV-FH AAV等载体的多克隆位点与我们的human ORF穿梭克隆相兼容,非常适于哺乳动物ORF的表达。

  第三步:收毒。分别收获培养基上清与细胞沉淀,PEG8000沉淀培养基上清中的病毒,培养基上清先用0.45um滤膜过滤。

  第四步:病毒纯化。通过碘克沙醇法对病毒进行纯化,一方面提高病毒滴度,另一方面某些动物实验需要纯化之后才可进行。

  第五步:滴度检测。用QPCR的方法来检测病毒的滴度,得到的结果为包装得到的病毒颗粒数。

  维真生物的pAV-FH AAV载体,具有Amp抗性、CMV启动子,带有Flag-His标签。多克隆位点与维真生物的human ORF穿梭克隆相兼容。非常适于哺乳动物ORF的表达。维真生物为您提供了多种表达shRNA的rAAV,包括U6或H1启动子和作为哺乳动物表达标记的GFP或RFP。同时,也可根据您感兴趣的基因提供shRNA设计服务。

  pAAV-rep/cap质粒(图)包含AAV编码复制蛋白和病毒衣壳蛋白的rep和cap基因,获得期望的高滴度病毒产品的关键基因。

  pHelper 质粒(图)包含AAV-HEK293T 生产高滴度病毒必须的的腺病毒基因VA,E2A 和E4 的集合。提供AAV 生产所必需的腺病毒蛋白质E1A 和E1B 在HEK293T 细胞中稳定表达。

  2)维真生物公司的AAV载体与我们的人源ORF库中的穿梭质粒的多克隆位点相兼容,通过酶切,连接,转化的方式将基因亚克隆进入pAV-FH AAV载体,得到阳性克隆之后进行酶切跑胶验证及测序以确认插曲片段的正确性。

  1)按照培养细胞流程,将细胞吹下来加入50ml离心管中, 800g离心5min。

  5)放入装有异丙醇的冻存盒中,放入-80度冰箱过夜。(冻存盒要提前一天从冰箱中拿至室温,使异丙醇的温度达到室温,每次冻存前确保异丙醇的加入量在刻度线)第二天将冻存盒放入液氮或-150℃冰箱中。

  1)10cm培养盘中加10cm新鲜DMEM培养基,放培养箱预热至37℃。

  2)从液氮中取出冷冻管,迅速投入37 ℃ ~38℃水浴中,使其融化(1-2分钟左右)。

  5)4h后待细胞完全贴壁后更换新鲜培养基(除去冻存液中DMSO对细胞的毒害作用。也可在第3步中800g离心5min,除去培养基后再悬浮细胞添加至新鲜预热的DMEM细胞培养皿中)。

  2)灭菌期间,DMEM培养基(含10%FBS,相关知识1%青链霉素混合液)、PBS以及0.25%胰酶在37℃水浴锅中预热。

  3)取汇合度接近100%活性好的的HEK293T细胞,吸弃培养盘中培养基,加约5ml,1 ×PBS,摇晃几下,吸弃PBS。(加PBS目的主要除去残留在皿中的培养基中的FBS,以提高胰酶的消化效率)

  4)加1ml 0.25% 胰酶在生物安全柜内消化约1min,室温低时可放置于培养箱中消化。消化时间不宜过长,否则影响细胞再次贴壁效率和活性。

  6)用移液管吹打均匀,按照1:3比例传代。各洗2ml培养基至新的10cm皿中,再加入8ml预热的DMEM培养基。(吹打过程中不可用力过大,否则会吹破细胞)。

  注意:传代盘数较多时,要先将预热的DMEM培养基加入到10cm皿中,再加入含细胞的培养基,以避免细胞分布不均。放置于培养箱前轻轻混匀皿中的培养基,使细胞均匀分散于培养基中。细胞培养条件为5%-7%CO2浓度,37℃,培养箱内无菌水盘内水份提供一定的湿度。

  细胞传盘以及分6孔板,24孔板,96孔板分细胞都经过上述流程,只是细胞数与分的比例不同,具体情况具体操作。

  第二天: 转质粒前1-2h左右,换成无血清培养基(所有血清型AAV),用转染试剂将目的基因质粒和辅助质粒(需用酚氯仿提取的质粒)转入HEK293T中。

  第五天:转染72h收毒。带着培养基,吹下细胞,离心;然后分别收获培养基上清与细胞沉淀。用PEG8000沉淀培养基上清中的病毒,沉淀过夜后收集病毒沉淀。

  1)腺性相关病毒处理破除AAV病毒外壳 ,37 ℃ 孵育30 min,然后加热 95 ℃5 min 使酶失活,体系如下:

  6)病毒颗粒数公式:病毒颗粒数(个/ml)= 与标准品相对值 × 1000

  以2型AAV病毒为例,维真生物为您推荐的MOI值10000:1-100000:1,是根HEK293T细胞得出的数据,不同的细胞所使用的病毒MOI值会有所不同。建议您感染目的细胞前,进行预实验摸索最佳MOI值,推荐使用有荧光的对照病毒来摸索条件。

  2. 将目的细胞接种于96孔板中,细胞融合率为50%为最佳。为保证细胞生长良好,请保证细胞贴壁过夜。

  3. 取10ul AAV病毒原液加入90 ul培养基中做1:100稀释(10-2),以此为起点做梯度稀释直至稀释10-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。

  4. 取出提前准备好的96孔板,先确定细胞生长状况是否良好。用准备好的病毒稀释液替代旧培养基,注意保留未加入病毒的细胞孔作为对照组。

  5. 在加入病毒稀释液后,请在12-24h后观察细胞状态来确认加入的病毒量是否合适,是否因为加入的病毒量影响细胞状态。如果细胞没有变化,即所加病毒对细胞没有毒性,可以继续培养。

  6. AAV病毒对细胞的感染较慢,请在感染细胞后每天观察细胞中荧光表达情况。 (成功案例: 山大医院学生

  一个星期后看到荧光表达,并且成功通过WB检测到目的基因的表达)(如果您选择的产品带有GFP标签,如果没有荧光标签请选择在96小时以后的不同时间段分别收获细胞并通过Western-Blot或其他检测手段来检测基因表达)。

  AAV虽然也可体外感染一些细胞,但感染效率比较低。具体感染效率可以参考本手册的常见问题解答中的附表。

  由于组织特异性,即便提高病毒的注射量,对于低表达的血清型,其所携带基因的表达水平没有太大的改善。由图可知,AAV9型对心肌细胞的感染效率极高,AAV8次之。

  分别用AAV1-6感染中枢神经系统,AAV1的效果好,感染运动神经元的数目最多。

  注射方法:在接近晶状体的虹膜上切开一个小口后,缓慢(20-30秒内)注射。至少在3个星期后进行后续的实验。

  AAV比腺病毒的持续表达时间要长很多,通常AAV可在体内表达数周甚至数月,但是腺病毒仅能表达几天。

  由图显示,AAV介导的在大鼠脊髓中的基因表达要比慢病毒介导的表达更高。AAV比慢病毒更容易转染脊髓。

  腺相关病毒(AAV)属于微小病毒科,是一类小的、二十面体、无包膜病毒。AAV是一种复制缺陷病毒,复制依赖于其他辅助病毒,如腺病毒和疱疹病毒。AAV不编码自己的聚合酶,因此其复制过程依赖于宿主细胞的聚合酶活性。

  重组AAV(rAAV)是人工改造的AAV,没有编码AAV病毒复制和结构蛋白的rep和cap基因。rAAV中与复制和包装相关的rep和cap 基因被替换为ITRs间的基因或结构,这使rAAV具有4.1-4.9 kb的包装容量。

  可在生物安全1级(BSL-1)实验室操作生产无辅助病毒和编码非致癌基因的重组AAV。另外,应在生物安全2级(BSL-2)实验室封闭处理具有生物危害性的材料。

  迄今为止,未发现野生型AAV有致病性。野生型AAV,在无需辅助病毒(如腺病毒)的存在下,复制效率非常低。重组腺相关病毒(rAAV)由多个质粒(cis质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒)组成。Cis质粒、辅助质粒与rep/Cap质粒之间不具有同源性序列,因此重组AAV在理论上不具有复制的能力。

  AAV具有〜4.7Kb的包装能力。2个ITR之间插入的DNA长度接近允许的最大值4.7Kb时,包装效率显著降低。例如,对于过表达来自cDNA的基因,CMV-poly(A)信号元件约为1KB,因此最大可包装的cDNA长度约为3.2kb,如果共表达GFP(约0.8kb),则可包装的容量大约为2.4kb。

  请同时参阅转染效率与不同细胞类型对照表,以确定哪种血清型AAV更适合您的细胞。

  rAAV病毒滴度很高,可感染分裂和非分裂细胞、免疫原性极小、体内表达外源基因时间长。

  纯化的AAV载体在4℃或更低温度下高度稳定。建议您将AAV分装后,-80℃下长期保存。

  您可以从我们的人源全长cDNA库(17,000预制ORF)中挑选,或者提供您的质粒DNA或DNA序列,我们将基因克隆至AAV载体。您还可以指定特定的融合标签和AAV血清型。

  基因沉默服务,请您提供确切的shRNA的序列以构建重组rAAV载体。我们的标准载体具有U6启动子和GFP标记。

  通常情况下,可为客户提供500 ul病毒液1×10^12 V.G. /ml。也可根据客户的需要,提供特定体积和滴度的产品。hth华体会网页登录入口

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